灯盏花素为菊科植物短葶飞蓬(灯盏细辛)中提取的黄酮类成分，主要药效成分为灯盏花乙素(野黄芩苷) 。灯盏花素片为灯盏花素制成的片剂，临床上被用于治疗高血压、脑血栓、多发性神经炎和慢性蛛网膜炎等脑血管意外所致的瘫痪。目前卫生部标准采用紫外法测定灯盏花素片的含量，由于灯盏花素是由灯盏花甲素和灯盏花乙素等多种黄酮组成的混合物 ，紫外分光光度法的选择性差，难以满足该药品质量控制的要求。有文献报道采用HPLC以黄芩苷为内标加校正因子法测定灯盏花素注射液中野黄芩苷的含量以及高效毛细管电泳法测定灯盏花素系列制剂的含量。本实验建立了以野黄芩苷为对照品，HPLC外标法测定野黄芩苷的含量。实验表明该方法操作简便，结果准确，理论塔板数2500以上。
1 样品及试剂
样品：灯盏花素片，由浙江泰利森药业有限公司提供(批号021001，021002，021003)。
阴性样品：按处方(不加灯盏花素)在实验室自行制备。
野黄芩苷对照品：中国药品生物制品检定所，批号842-200102(暂行批)，含量按面积归一化法计算为94.87％ 。
甲醇、四氢呋喃为色谱纯试剂，磷酸为优级纯，流动相用水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
2 仪器及色谱条件
2．1 仪器
岛津LC-1OATVP溶液输送泵，岛津SPD-10AVP检测器，77251进样阀，10μL定量环，浙江大学N2000数据工作站，
SJ2200
超声波清洗 器。
2．2 色谱条件
色谱柱：Shimpack VP-ODS4.6mm×15cm ；流动相：甲醇．四氢呋喃-0.3％磷酸溶液(12：13：75)；流速：1.0mL／min；检测波长：335nm；进样量：10μL；灵敏度：0.05AUFS。
在此条件下测得的样品色谱图，有很好的分离效果，分离度大于1.5，理论塔板数大于2500。
3 方法及结果
3．1 对照品溶液的配制
精密称取野黄芩苷对照品适量，加甲醇至100mL，制成含野黄芩苷250μg／mL的对照品储备液。精密量取储备液5mL加80％ 甲醇至25mL，得野黄芩苷对照液(50μg／mL)。
3．2 标准曲线
分别吸取“3．1”项下野黄芩苷对照品储备液1，2，4，6，8，lOmL，分置25mL量瓶中，加80％甲醇至刻度，摇匀，分别吸取10μL在规定条件下进样，以对照品浓度C(μg／mL)为纵坐标，色谱峰面积A为横坐标，得一条直线。回归方程为C=0.3412,4+6.604×0.000001；r=0.9999；(n=6)。线性范围l0～lO0μg／mL。结果表明，线性关系良好。
3．3 精密度试验
取“3．1”项下野黄芩苷对照液10μL在规定条件下重复进样5次，测定峰面积，RSD为1.39％。
3．4 阴性试验
按处方工艺要求，不加灯盏花素，在实验室自制阴性样品，按3．8样品测定法操作，在规定条件下进样。由色谱图可知：本方法测定无其它成分干扰。
3．5 稳定性试验
取“3．8”项下同一样品溶液在0，3，6h分别进样，记录峰面积，RSD为1.15％。日间连续测定3d，记录峰面积，RSD为1.31％ 。
3．6 重现性试验
取3．8项下同一样品在规定条件下测定8份平行样，平均结果为18.36mg／片，RSD为1.61％ 。
3．7 加样回收率试验
精密称取对照品适量，加甲醇至100mL，制成含野黄芩苷500μg／mL的溶液。精密量取该溶液10mL加入到已知含量的样品中，以下同3．8项下样品溶液的制备法制得加样供试液，吸取l0μL，按色谱条件测定峰面积。
3 ．8 样品测定
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于灯盏花素lOmg)，置50mL量瓶中，加甲醇约40mL，超声振摇10min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀滤过，弃去初滤液，取续滤液5mL，加80％甲醇至25mL做供试液。在规定条件下分别取供试液及“3．1”项下野黄芩苷对照液各l0 进样，结果用峰面积外标法计算即得。
3．9 实验结果
按规定实验方法测定3批样品，结果为：021001：18.0mg／片；021002：18.4mg／片；021003：17.3mg／片。
4 讨论
4．1 作者曾选用甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-四氢呋喃-水等流动相系统试验，结果用甲醇-四氢呋喃-水(12：13：75)为流动相时，野黄芩苷与其他峰可分开，保留时间约为13min；又野黄芩苷分子结构中羟基易电离而使色谱峰扩散，故在流动相中加入少量酸抑制其色谱峰拖尾，曾采用0.1％，0.3％，0.5％磷酸液(pH分别为2.5，2.2，2.0)试验，后两者效果较好，考虑到色谱柱使用范围，本方法选择了0.3％的磷酸液。
4．2 样品制备时作者曾选用纯甲醇、80％甲醇作溶剂，结果表明用80％甲醇作溶剂所得的色谱峰峰形更好，本方法选用80％甲醇作溶剂。
4．3 本实验建立了HPLC测定灯盏花素片中野黄芩苷的含量，具有方法简便，灵敏，准确性和重现性均好的特点，不受灯盏花素片中其它成分的干扰。较真实的反映了样品中野黄芩苷的实际含量。
